因子VIII是一种分子量约为280 kDa的血浆蛋白。它在血浆中的浓度非常低（100-200 ng/mL）。在血液中，因子VIII通过与血管性血友病因子(vWF)结合而稳定下来，这大大延长了其在血液循环中的半衰期。在没有vWF的情况下，因子VIII活性会迅速从血液中清除。BIOPHEN™ FVIII:C试剂盒是一种显色法，使用手动或自动淀粉酶分解法体外定量测定柠檬酸化人血浆或治疗浓缩物中因子VIII活性(FVIII:C)。本文是一篇HYPHEN因子FVIII活性测定试剂盒(221402)说明书，主要介绍了因子FVIII活性测定试剂盒的检测原理和使用方法。

一、因子FVIII活性测定试剂盒检测原理

BIOPHEN™因子VIII:C方法涉及FVIII:C辅因子的显色测定。在磷脂（PLP）和钙的存在下，由凝血酶激活的FVIII:C与因子IXa形成酶复合物，从而激活因子 X。产生的因子Xa水解显色底物，释放硝基苯胺（pNA）。释放的pNA量（通过405 nm处的吸光度测量）与样本中FVIII:C的浓度成正比（因子IXa、凝血酶和因子X处于恒定过量）。

二、因子FVIII活性测定试剂盒使用方法

1.样本的采集和准备

通过静脉穿刺将血浆小心地收集到柠檬酸三钠抗凝剂（0.109 M，3.2%）中，血浆与柠檬酸三钠抗凝剂比例为9：1。

2.将校准品和对照品按相应要求稀释。按照下表所述在R4缓冲液中稀释校准品，以制备校准曲线（“C”表示FVIII:C的浓度）。

高范围(0 - 200%)：

当使用商用校准血浆（例如：BIOPHEN™ Plasma Calibrator）建立校准曲线时，1:40稀释度对应于FVIII:C的指示浓度(C)，1:20稀释度对应于该浓度的两倍。对于滴度为C的校准物，通过按以下倍数稀释该校准物可获得200%水平（在测定条件下）：20x(C)/100。

制备1 mL 1/20正常血浆稀释液，或FVIII:C滴定校准血的 (20xC/100) 稀释液（例如C1）。此溶液的FVIII:C滴度为200%。通过在R4缓冲液中进行连续稀释来制备以下校准曲线，如下表所述：

低范围(0 - 25%)：

可以使用柠檬酸化正常血浆或已知FVIII:C浓度（即C）的商业校准血浆进行校准。在FVIII:C缺乏血浆(DP040A/K-RUO) 中稀释该血浆，以达到25%的浓度（正常血浆的缺乏血浆稀释倍数为4，浓度为C的校准血浆池的稀释倍数为 4xC/100）。

测定方法包括1:10血浆稀释。校准曲线范围为0至25% FVIII:C。R4缓冲液中的1:10稀释代表25% FVIII:C。

使用此溶液，在R4缓冲液中建立以下校准曲线：

使用前立即准备校准曲线以避免FVIII：C降解。

2.按照下表所述，在R4缓冲液中稀释样本：

对于FVIII:C治疗浓缩物，在R4中预稀释测试样本（高范围），目标是FVIII:C 浓度约为1 IU/mL。建议进行预稀释，以便将理论FVIII:C浓度调整到0.2 - 2 IU/mL之间，然后在R4中稀释1/40进行测试。预期的FVIII:C浓度在20%至200%之间。（然后将测量的浓度乘以“预稀释”因子）。

建立校准曲线并用质量控制进行测试。如果储存在室温（18-25℃）下，请快速测试稀释样本。试剂盒附带的说明上注明了每批的准确校准剂和控制浓度。

3.将以下物质加入微孔板孔中，或加入37℃孵育的试管中：

*或醋酸（20%）。黄色稳定2小时。

标本空白通过按与测试相反的顺序混合试剂获得：柠檬酸（2%）、R3、R2、R1、稀释标本。

测量405 nm处的光密度。从相应测试的吸光度中减去测量的空白值。

如果样品黄疸、脂血、溶血或其颜色与标准血浆不同，则创建血浆空白。

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