细胞培养是指将细胞从动物或植物体内取出，然后在适宜的人工环境中生长的过程。细胞可以在培养前直接从组织中取出并通过酶或机械方法进行解离，也可以来源于已建立的细胞系或细胞株。细胞培养对于研究细胞生物学、药物筛选和治疗等方面具有重要应用。

细胞培养根据细胞种类的不同，可分为原代培养和传代培养。原代培养是指从体内取出的组织或细胞进行的首次培养。传代培养是指需要将培养物分散后，从一个培养瓶（皿）以一定比率重新接种到另外的培养瓶（皿）内，再进行培养的过程。本文将介绍细胞复苏、细胞传代培养和细胞冻存的具体操作方法。

一、细胞复苏

（一）所需材料

新鲜培养基，离心管，培养瓶，恒温水浴锅等。

（二）具体步骤

1.从液氮罐或-80℃冰箱取出冻存管，立即放入37℃水浴箱中快速融化，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，移入无菌操作台内。

2.打开冻存管，吸取细胞悬液到一新的离心管中，1000rpm离心10分钟，弃去上清液。

3.向离心管中加入新鲜培养基，重悬。

4.吸取细胞悬液，接种于新的培养瓶中，进行培养。 

二、传代培养

（一）所需材料

新鲜培养基，胰酶，培养瓶，超净工作台，CO₂培养箱，倒置显微镜，离心机等。

（二）贴壁细胞传代

1.倒置显微镜下观察细胞形态和生长密度，当细胞生长密度达到80%~90%时，进行传代。

2.吸去培养瓶中原有培养基。加入细胞消化液（如胰蛋白酶），37℃消化细胞。

3.倒置显微镜下观察到贴壁细胞逐渐变圆，慢慢脱落，在还未飘起时弃掉胰酶，加入含有10% FBS的新鲜培养基，终止消化。

4.用移液器轻轻吹打细胞，将细胞全部吹下后，制备成细胞悬液，对细胞进行计数，然后分装到新培养瓶中，将培养瓶放于CO₂培养箱。 

（三）悬浮细胞传代

1.观察悬浮细胞生长状态，当细胞悬液变黄时，进行传代。

2.直接传代法：吸取细胞上清液，加入新鲜培养液，接种于新的培养瓶中。

3.离心传代法：离心细胞悬液，重悬细胞，接种于新的培养瓶中。

三、细胞冻存

（一）材料

冻存管，冻存液，细胞冻存盒，液氮罐

（二）具体步骤

1.吸取传代后的细胞悬液，离心，弃掉原有培养基，加入冻存液，分装到无菌冻存管中。

2.冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，可增至-5～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。 

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