胃内的Lgr5 +成体干细胞经过分离、培养，最终分化成胃类器官。肿瘤类器官（Patient-derived organoids,PDOs）是一种利用来源于癌症病人自身的肿瘤细胞，在体外培养出来的肿瘤细胞模型。肿瘤类器官的组织结构、细胞类型和基因特征与患者本人的肿瘤高度一致，能够作为替身，为患者试药。胃癌类器官药敏检测技术，是精准医学领域里程碑式的重大突破，也是提高胃癌治疗有效性较为直接的方法，可以让患者少走弯路、少受痛苦，为临床医生更精准地选择抗胃癌药物提供更直观更可靠的依据。

一、实验前准备

（1）15mL无菌离心管、1.5mL离心管、24孔细胞培养板、移液器、移液管、无菌枪头等表面消毒后放入生物安全柜中紫外照射30min。

（2）提前30min从4℃冰箱取出胃癌类器官培养基平衡至室温，提前1h从-20℃冰箱取出所需体积的基质胶冰上融化。

二、胃癌类器官培养

（1）将获取的胃癌原代细胞悬液计数，根据计算好的体积吸取细胞悬液加入预冷的1.5 mL离心管中。
（2）补齐预冷的培养基至所需体积，将预冷后的细胞悬液加入等体积的基质胶中轻轻混匀（全程冰上操作），使得胃癌原代细胞终浓度为5×10⁶个细胞/毫升。

（3）然后将细胞与基质胶的混合液按照50μL/孔呈半球形点胶于24孔板。
（4）将培养板放入5%CO₂ 37℃培养箱中30min，待基质胶完全凝固。
（5）沿孔壁每孔缓慢加入500μL预先恢复至室温的类器官培养基，置5%CO₂ 37℃培养箱培养。
（6）3天后镜下观察类器官形成情况，粒径大于30~50μm即认为类器官已经形成，每3天更换一次培养基进行培养，持续观察类器官大小，镜下观察大部分类器官大小均大于30~50μm且大小不再增大即可收集类器官进行后续实验。

三、胃癌类器官收集

（1）弃培养基，每孔加入200μL基质胶解离试剂，室温放置1min。
（2）轻轻吹打混匀，收集至15mL离心管中，50rpm恒温震荡解离10-20min，解离之后1500rpm离心3 min，轻轻吸去上清，待用。

四、胃癌类器官传代

（1）收集的类器官，加入适量的消化酶，37℃，200rpm消化（具体时间根据类器官大小和数量决定，以肉眼可见颗粒明显减小一半为准，可中间取消化的类器官显微镜观察，类器官消化至3~10个细胞集合体最佳）。
（2）消化完全后1500rpm离心3min，弃上清，使用清洗液重悬后1500rpm离心3min。
（3）加入预冷的胃癌类器官培养基进行重悬，计数，按照培养步骤操作继续培养。