Annexin V-FITC/PI双染法是一种常用的方法来检测细胞凋亡。这种方法利用Annexin V-FITC（荧光素标记的Annexin V）和PI（甲基红荧光素标记的DNA染料）来区分凋亡和非凋亡的细胞。本文主要介绍Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测原理、实验方法和注意事项，一起来学习吧！

一、Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测原理

Annexin V 是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸 (PS) 有高度亲和力。当细胞发生凋亡时，膜内侧的磷脂酰丝氨酸 (PS) 外翻到膜表面，而被荧光染料FITC标记的Annexin V结合，可通过流式细胞仪或荧光显微镜进行检测。

由于凋亡晚期或坏死细胞膜丧失完整性，而碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）可与双链DNA特异性结合并产生强烈的荧光，与Annexin V搭配使用，可区分处于不同凋亡时期的细胞。

二、Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡实验方法

1.细胞按照实验方案进行凋亡诱导，300 ×g离心5 min，弃上清，收集细胞，PBS洗涤一次，轻轻重悬细胞并计数。

2.取1~5×10⁵重悬的细胞，300 ×g离心5 min，弃上清。用PBS洗涤细胞一次，离心后弃上清，加入100 μL稀释的1 × Annexin V Binding Buffer 重悬细胞。

3.细胞悬液中加入2.5 μL的Annexin V-FITC Reagent和2.5 μL的PI Reagent (50μg/mL)。

4.轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育15~20 min。

5.加入400 μL稀释的1 × Annexin V Binding Buffer，混匀样本。

6.立即上机检测。如不能及时检测，请于冰上避光静置并于1小时内完成检测。

三、Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测注意事项

1.检测贴壁细胞时，需收集诱导凋亡后产生的悬浮细胞，并与后续收集的贴壁细胞一起检测。

2.应尽量避免消化贴壁细胞带来的机械损伤。同时，胰酶的消化液中应尽量不含EDTA，因为EDTA会影响Annexin V与磷脂酰丝氨酸的结合。

3.如果使用含EDTA的胰酶，收集细胞后应充分清洗，确保EDTA被去除干净。

4.染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。

5.荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。

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