在WB实验中，转膜是一个承上启下的步骤，它的重要性不言而喻。因此，掌握转膜技巧，至关重要。

一、WB实验中的转膜技巧

1、选择合适的膜

不同的膜具有不同的特点，需要根据实验的具体需求进行选择。转移分子量小于20kDa的蛋白时建议使用小孔径的膜 (如0.22μm)，正常情况下使用0.45μm孔径的膜即可。

2、配制正确的缓冲液

它会影响到蛋白的转移效果。转膜过程会伴随严重的发热现象，建议提前配好缓冲液并在4 ℃冰箱进行预冷。建议在4 ℃条件下进行转膜，或在电泳槽的周围放冰块或冰袋，进行冰水浴以达到降温目的。

3、处理蛋白浓度和样本时要注意

过高或过低的蛋白浓度都可能影响实验结果。
4、控制转膜时间和条件

过长或过短的时间，以及不合适的条件都可能导致转膜失败。

二、转膜的具体操作步骤
1、裁减6张滤纸（大小要比胶大，比海绵层小），放入大皿中，使其浸湿；

2、裁减硝酸纤维素膜（大小跟胶一样大），放入上述大皿中，使其浸湿；

3、打开转移器材，将海绵浸湿，覆盖在黑面上（黑面对着自己），提着滤纸的上沿将滤纸提起，慢慢将滤纸的另一端放在海绵上。再如上述方式增加两片滤纸，共3层滤纸。注意：第一张滤纸和黑面之间不要产生气泡，若有气泡，可以加blotting buffer将气泡滚出；

4、如放滤纸的方式一样，将胶置于在滤纸上，若胶有卷边，可切去一小部分。注意：胶和滤纸之间不要产生气泡；

5、用铅笔在胶角落上标记，标为正面，然后，双手提起膜，将做标记的一面向下，由下向上缓慢将膜覆盖在胶上，去除两者之间的气泡；

6、同2中的方法放上三张滤纸，盖上海绵，再将转移盒合上；

7、将转移盒放入转移槽中，黑靠黑，白靠红，将大皿中的blotting buffer倒入其中，如不足，可再加入瓶中的blotting buffer，直至覆盖住胶和膜所在的位置。同时检查电极是否接错：蛋白质带负电荷，从负极向正极走，即胶—膜对应于负极—正极；

8、电转移：a.4 ℃，40mA，overnight（10-12h）；b.4 ℃（冰水浴），300mA，1.5h。（电流大小随蛋白增大而增大）。

三、WB实验中的转膜注意事项

1、转膜时防止气泡的产生，因为气泡会影响转膜效果；

2、处理和保存膜时需要注意，不要徒手拿凝胶和PVDF膜。因为手指上的油脂和分泌物不仅会在显色后出现痕迹，从而干扰判定，而且还会封闭转移膜，阻止蛋白质从凝胶转向PVDF膜；

3、转膜过程应迅速，以防止蛋白条带的扩散，同时要确保膜和凝胶保持湿润。

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