zymo试剂盒D4068(Quick-DNA™ Miniprep Plus Kit)是一款简单快速的DNA提取试剂盒,可从细胞培养物、固体组织、唾液和任何生物体液样本中提取高产量总DNA(例如基因组、线粒体、病毒)。试剂盒独有的试剂和Zymo-Spin技术可在35 µl的量内洗脱超纯浓缩基因组DNA(> 50 kb)。Zymo-Spin柱可确保无缓冲液滞留。纯化的DNA不含RNA,无需 RNase A处理,并确保文库制备等应用的准确定量。分离的DNA适合用于敏感的下游应用,包括qPCR、DNA-seq、阵列和甲基化分析。
一、Zymo试剂盒D4068组分
Quick-DNA™ Miniprep Plus Kit | 规格 | 保存温度 |
Proteinase K & Storage Buffer1 | 20 mg | −20°C (混合后) |
BioFluid & Cell Buffer (Red) | 12 ml | 室温 |
Solid Tissue Buffer (Blue) | 6 ml | 室温 |
Genomic Binding Buffer | 25 ml | 室温 |
DNA Pre-Wash Buffer | 30 ml | 室温 |
g-DNA Wash Buffer | 50 ml | 室温 |
DNA Elution Buffer | 10 ml | 室温 |
Zymo-Spin™ IIC-XLR Columns | 50 | 室温 |
Collection Tubes | 100 | 室温 |
Instruction Manual | 1 | 室温 |
注:1.使用前,向每个Proteinase K(20 mg)管中添加1,040 µl Proteinase K Storage Buffer。Proteinase K的最终浓度约为20 mg/mL。混合后储存于-20ºC。
二、Zymo试剂盒D4068使用流程
(一)样本准备
1.细胞单层样本制备
以下步骤适用于最多5×106个单层细胞。虽然细胞类型和培养条件可能有所不同,但该方案适用于高密度生长细胞(例如HeLa细胞)以及低密度生长细胞(例如神经元细胞)。
用胰蛋白酶消化或从培养瓶或培养板中刮下粘附细胞。以约500 x g的速度离心悬浮液5分钟。去除上清液,将细胞沉淀物重新悬浮在1 ml PBS(磷酸盐缓冲盐水)中,然后将悬浮液转移到微量离心管中。以约500 x g的速度离心悬浮液5分钟。丢弃上清液,后续提取流程按照生物液体和细胞工作流程进行操作。
2.口腔细胞和拭子
口腔细胞可以使用冲洗或拭子分离法分离。
A.冲洗法:用10-20 ml盐溶液或漱口水大力漱口30秒。冲洗动作越剧烈,回收的细胞就越多。将盐水吐入50 ml试管中,以1,500 rpm的速度沉淀细胞5分钟。丢弃上清液,不要扰动细胞沉淀。后续提取流程从生物体液和细胞工作流程的第1步继续进行操作。
B.拭子分离方法:在分离细胞前,用水彻底漱口。用口腔拭子刷脸颊内侧15秒(约刷20次),确保覆盖整个内颊区域。使用200 µl BioFluid & Cell Buffer (Red)和200 µl DNA Elution Buffer或其他等渗溶液的混合物将刷子冲洗到微量离心管中。加入20 µl Proteinase K,充分混合,并在55ºC下孵育10分钟。后续提取流程从生物体液和细胞工作流程的第3步继续(如果需要,稀释或去除样本以减少细胞计数)。
(二)工作流程
使用DNA洗脱缓冲液或等渗缓冲液(例如PBS)重悬培养细胞或大肠杆菌沉淀。对于˂1 x 106个细胞,重悬于100 µl;对于1-5×106个细胞,重悬于200 µl。
A.生物体液和细胞
1.将最多200 µl1样品加入微量离心管中,并添加:200 µl BioFluid & Cell Buffer (Red)、20 µl Proteinase K。
若样本量˂ 200 µl,按比例减少BioFluid & Cell Buffer (Red)和Proteinase K。
2.充分混合或涡旋10-15秒,然后在55℃下孵育10分钟2,3。
3.将1倍体积的Genomic Binding Buffer加入消化后的样本中。彻底混合或涡旋10-15秒。
示例:将105 µl Genomic Binding Buffer添加到105 µl消化样本中。
B.固体组织
1.将组织样本(≤ 25 毫克)放入微量离心管中,加入以下试剂:95 µl水、95 µl Solid Tissue Buffer (Blue)、10 µl Proteinase K。
2.充分混合或涡旋10-15秒,然后将管在55˚C下孵育1-3小时或直到组织溶解2。继续操作前充分混合3。
3.将2倍体积的Genomic Binding Buffer加入到上清液中。充分混合或涡旋10-15秒。
示例:将400 µl Genomic Binding Buffer添加到200 µl混合物中。
4.将混合物转移到Collection Tube中的Zymo-Spin™ IIC-XLR柱中。以≥12,000 x g的速度离心1分钟4。丢弃流出物和收集管。
5.将400 µl DNA Pre-Wash Buffer添加到新Collection Tube中的旋转柱中。以≥12,000 x g 的速度离心1分钟。清空收集管。
6.将700 µl g-DNA Wash Buffer加入离心柱。以≥12,000 x g的速度离心1分钟。清空收集管。
7.将200 µl g-DNA Wash Buffer加入离心柱中。以≥12,000 x g的速度离心1分钟。丢弃流出物和收集管。
8.将旋转柱转移到干净的微量离心管中。直接在基质上添加≥50 µl DNA Elution Buffer或水5。室温下孵育5分钟,然后以最大速度离心1 分钟以洗脱DNA6。洗脱的DNA可立即用于基于分子的应用或储存在≤-20ºC以备将来使用。
注:1.如果使用<50 µl样品,请使用DNA Elution Buffer或等渗缓冲液(例如PBS)将体积增加至50 µl,然后再继续。
2.可以过夜消化而不会影响DNA的完整性。
3.要去除不溶性碎片,请以≥12,000 x g的速度离心1分钟。将水性上清液转移到干净的微量离心管中。避免转移脂质层和沉淀的细胞碎片。
4.如果裂解物在基质顶部仍然可见,请再离心一分钟或直到完全澄清。
5.DNA Elution Buffer:10 mM Tris-HCl,pH 8.5,0.1 mM EDTA。如果使用水,请确保pH > 6.0。
6.用 60-70℃ DNA Elution Buffer洗脱DNA可以提高总产量。另外,第二次上样洗脱液,在室温下孵育3分钟,再次离心也可以提高总产量。
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