免疫荧光实验是一项基于免疫学、生物化学和显微镜技术的方法。它利用抗原抗体反应的原理，首先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，然后使用这种荧光抗体（或抗原）作为探针，检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。通过荧光显微镜，可以观察荧光在组织中的分布，从而确定抗原或抗体的性质、定位以及定量信息。

免疫荧光根据检测方法可分为直接免疫荧光和间接免疫荧光。直接免疫荧光是指将荧光素标记在特异性抗体上，直接检测标本中的相应抗原。间接免疫荧光是指以特异性抗体（或待测抗体）为第一抗体，以荧光素标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体为第二抗体，用于检测样本中的相应抗原或抗体。

一、直接免疫荧光实验流程（以细胞样本为例）

1.制片：收集细胞，制作玻片；

2.固定：室温下，用4%多聚甲醛（溶于PBS中，pH 7.4）孵育细胞10min，固定细胞。用缓冲液PBS洗细胞3次。

3.通透（根据实验选择）：用PBS（含0.1-0.25% Triton X-100）孵育样品10分钟。

4.封闭：用10%山羊血清封闭将样本完全覆盖，封闭抗体的非特异性结合，置于湿盒内，孵育30min。

5.孵育：室温下，用适当稀释的荧光标记的抗体在湿盒内孵育细胞1h。

6.洗涤：弃去抗体工作液，用缓冲液PBS洗涤细胞3次，每次5 min。

7.复染：在玻片上滴加DAPI，避光孵育5min。

8.洗涤：用缓冲液PBS洗涤3次，每次5min。

9.荧光检测：盖上盖玻片，置于荧光显微镜下观察。

二、间接免疫荧光实验流程（以细胞样本为例）

1.制片：收集细胞，制作玻片；

2.固定：室温下，用4%多聚甲醛（溶于PBS中，pH 7.4）孵育细胞10min，固定细胞。用缓冲液PBS洗涤细胞3次。

3.通透（根据实验选择）：用PBS（含0.1-0.25% Triton X-100）孵育样品10分钟。

4.封闭：用10%山羊血清封闭将样本完全覆盖，封闭抗体的非特异性结合，置于湿盒内，孵育30min；

5.一抗孵育：室温下，用适当稀释的抗体在湿盒内孵育细胞1h；

6.洗涤：弃去一抗工作液，用缓冲液PBS洗涤细胞3次，每次5 min。

7.二抗孵育：在样本上滴加与一抗种属对应的荧光二抗工作液，样本需完全覆盖，避光，37℃，孵育1小时；

8.洗涤：弃去二抗工作液，用缓冲液PBS避光洗涤3次，每次5分钟；

9.复染：在玻片上滴加DAPI，避光孵育5min。

10.洗涤：用缓冲液PBS洗涤3次，每次5min。

11.荧光检测：盖上盖玻片，置于荧光显微镜下观察。

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