免疫荧光实验是一项基于免疫学、生物化学和显微镜技术的方法。它利用抗原抗体反应的原理,首先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团,然后使用这种荧光抗体(或抗原)作为探针,检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。通过荧光显微镜,可以观察荧光在组织中的分布,从而确定抗原或抗体的性质、定位以及定量信息。
免疫荧光根据检测方法可分为直接免疫荧光和间接免疫荧光。直接免疫荧光是指将荧光素标记在特异性抗体上,直接检测标本中的相应抗原。间接免疫荧光是指以特异性抗体(或待测抗体)为第一抗体,以荧光素标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体为第二抗体,用于检测样本中的相应抗原或抗体。
一、直接免疫荧光实验流程(以细胞样本为例)
1.制片:收集细胞,制作玻片;
2.固定:室温下,用4%多聚甲醛(溶于PBS中,pH 7.4)孵育细胞10min,固定细胞。用缓冲液PBS洗细胞3次。
3.通透(根据实验选择):用PBS(含0.1-0.25% Triton X-100)孵育样品10分钟。
4.封闭:用10%山羊血清封闭将样本完全覆盖,封闭抗体的非特异性结合,置于湿盒内,孵育30min。
5.孵育:室温下,用适当稀释的荧光标记的抗体在湿盒内孵育细胞1h。
6.洗涤:弃去抗体工作液,用缓冲液PBS洗涤细胞3次,每次5 min。
7.复染:在玻片上滴加DAPI,避光孵育5min。
8.洗涤:用缓冲液PBS洗涤3次,每次5min。
9.荧光检测:盖上盖玻片,置于荧光显微镜下观察。
二、间接免疫荧光实验流程(以细胞样本为例)
1.制片:收集细胞,制作玻片;
2.固定:室温下,用4%多聚甲醛(溶于PBS中,pH 7.4)孵育细胞10min,固定细胞。用缓冲液PBS洗涤细胞3次。
3.通透(根据实验选择):用PBS(含0.1-0.25% Triton X-100)孵育样品10分钟。
4.封闭:用10%山羊血清封闭将样本完全覆盖,封闭抗体的非特异性结合,置于湿盒内,孵育30min;
5.一抗孵育:室温下,用适当稀释的抗体在湿盒内孵育细胞1h;
6.洗涤:弃去一抗工作液,用缓冲液PBS洗涤细胞3次,每次5 min。
7.二抗孵育:在样本上滴加与一抗种属对应的荧光二抗工作液,样本需完全覆盖,避光,37℃,孵育1小时;
8.洗涤:弃去二抗工作液,用缓冲液PBS避光洗涤3次,每次5分钟;
9.复染:在玻片上滴加DAPI,避光孵育5min。
10.洗涤:用缓冲液PBS洗涤3次,每次5min。
11.荧光检测:盖上盖玻片,置于荧光显微镜下观察。
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