免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是一项利用抗体在组织切片或细胞涂片上检测抗原并将其可视化的技术。这种方法通过抗原-抗体反应的原理，利用标记抗体来显示组织或细胞中抗原物质的位置。在病理学、肿瘤诊断和研究领域中，免疫组织化学技术有着广泛的应用。

一、免疫组织化学原理

首先从待检组织或细胞中提取蛋白作为抗原，然后通过免疫动物获取特异性抗体，或直接购买特异性抗体，利用这些抗体来探测并结合组织（或细胞）中的抗原。随后利用带有显色剂标记的二抗进行检测，以显示细胞的轮廓，通过显微镜观察，可以对组织或细胞内蛋白的定性和定位进行研究。

二、免疫组织化学实验步骤（以石蜡切片为例）

（一）脱蜡与水化

1.60℃加热20分钟→二甲苯：2次×10分钟；

2.100%乙醇2次×5分钟；

3.95%乙醇2分钟；

4.80%乙醇2分钟；

5.70%乙醇2分钟；

6.蒸馏水5分钟；

7.PBS洗涤3次，每次3分钟。

（二）细胞通透、封闭内源性过氧化物酶

1.使用封闭通透液浸泡切片30分钟（室温避光）。

2.配制方法是在预热40mL PBS中加入120ul TritonX-100，加热数分钟，临用前再加入400 ul 30％H₂O₂。

3.PBS溶液洗涤3次，每次3分钟。

（三）抗原修复、暴露抗原决定簇

常用的修复方法一般有三种：高压修复、微波修复、胰酶修复。

1.将切片放入0.01M柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）后，放入微波炉中高火4分钟至沸腾，取出后冷却至室温，再加热，重复约4次，每次间隔补充液体，以防止切片干燥。

2.PBS溶液洗涤3次，每次3分钟。

（四）封闭非特异性蛋白

1. 取出切片，用滤纸吸干周围的水分，用组织笔在组织周围勾画圈，将5%羊血清（与二抗相同来源）滴在圈内后放入湿盒中，在室温（约30℃）下孵育10～30分钟。

（五）一抗孵育

1. 去除切片上的羊血清，用滤纸擦干周围残留的血清，直接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后，放入湿盒中，在室温下孵育1小时，然后在4℃条件下过夜，取出后需在37℃下复温45min。

（六）二抗孵育

1. 倒掉一抗并用PBS洗涤5次，每次5分钟；

2. 用滤纸吸去圈周围的水分，加入已稀释的二抗后放入37℃恒温箱中30分钟。

3. 用PBS洗涤5次，每次5分钟。

（七）染色（以SP法为例）

1. 加入SP复合液后放入37℃烤箱中30分钟。

2. 用PBS洗涤5次，每次5分钟。

（八）显色、复染、脱水、透明、封片、镜检

1. 用PBS洗涤3次，每次3分钟，然后用双蒸水洗5分钟；加入一滴苏木素染液（染胞浆或胞膜蛋白20秒），冲洗后用双蒸水洗5分钟，再用PBS返蓝5分钟。

2. 脱水：50%乙醇浸泡1-2分钟；70%乙醇浸泡1-2分钟；95%乙醇浸泡1-2分钟；100%无水乙醇浸泡1-2分钟；100%无水乙醇浸泡1-2分钟。

3.透明：二甲苯(1-2) min，1次→二甲苯(1-2) min，2次

4.封片：中性树胶。