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CRISPR的新型RNA敲低工具问世,效率更高、脱靶率更低

admin 2022-07-06 公司促销

    2012年,CRISPR 基因编辑技术问世以来,科学家们致力于人类缺陷基因的修正、改变病原体的基因、改变农作物的基因等,从而达到治疗遗传疾病、消灭传染病、培育优势品种等目的。

    2020年,加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna和马克斯普朗克研究所的Emmanuelle Charpentier为此共同获得了当年的诺贝尔化学奖,CRISPR 编辑技术的应用也进一步的加强。
    近日,
Jennifer Doudna 团队在bioRxiv上发表了题为:Precise Transcript Targeting by CRISPR-Csm Complexes 的研究论文,介绍了CRISPR 技术在靶向RNA敲低(Knockdown)领域上的最新应用成果:在最小化脱靶效应的前提下,研究团队利用CRISPR-Csm系统在人类细胞中实现了高效的 RNA 靶向敲低,其效率最高可达99%该研究表明 CRISPR-Csm 兼具现有技术的多种优势特点,可以作为一种高效、特异和多功能的 RNA 敲低工具。
RNAiCas13RNA的靶向敲低难题
    在不对
DNA 造成改变的情况下,改变细胞和生物体中RNA和蛋白质的水平对基础和医学研究具有重要意义。
    在过去的20年里,研究者们已经成功利用
RNA干扰(RNAi技术实现了真核生物中的靶向RNA敲低。这种技术利用小干扰RNAsiRNA引导内源性核酸酶切割携带互补序列的靶向RNA。然而,RNAi 技术存在着一些固有的局限性。例如,RNAi可能会意外切割具有部分互补序列的靶标。此外,siRNA在靶向细胞核RNA方面效率不高,因为RNAi机制主要存在于细胞质中。
CRISPR-Cas技术可以作为RNA敲低的另一个选择。与RNAi类似,Cas核酸酶利用小RNAcrRNAs通过碱基互补配对来识别核酸目标。但是,RNAi引导的内源性核酸酶不同,Cas核酸酶不仅仅顺式切割互补RNA,同时也会反式降解附近的非互补RNA

CRISPR的新型RNA敲低工具问世,效率更高、脱靶率更低

Cas13顺式和反式切割示意图

    已有学者基于Cas13 的反式切割活性开发出了病毒RNA检测工具。然而,近期研究表明Cas13在真核细胞中的反式切割活性会导致细胞毒性或细胞死亡。
超越RNAiCas13RNA敲低进入Csm时代
    由于现有方法的低效和不精确,目前很难在哺乳动物细胞中实现可靠和
精准RNA敲低。因此,研究人员致力于开发具有更高特异性和更广泛靶向能力的新型RNA敲低工具。CRISPR-Csm就是其中的一个重要尝试。
           CRISPR-Csm来自原核生物的IIICRISPR免疫系统,同时具有目标RNA依赖的脱氧核糖核酸酶DNase和环寡腺苷酸cOA合成酶活性。与 RNAi不同,Csm可以定位到细胞核,可用于靶向非编码RNA和前体mRNA。与Cas13相比,Csm也具有其特有的优势,因为Csm 仅在crRNA标靶互补区产生顺式切割,而不发生反式切割事件,从而避免了 Cas13 可能导致的细胞毒性或细胞死亡。
    在本研究中,
Jennifer等人选择了来自嗜热链球菌Streptococcus thermophilusCsm来建立哺乳动物细胞中的CRISPR-Cas系统,并尝试对3个细胞核非编码RNA和8个细胞质mRNA进行靶向敲低,每个靶点测试三个crRNA
    结果显示,与非靶向的
crRNA对照组相比,实验组crRNA实现了对全部11个 RNA靶点的分别敲低,且效率均在90%以上,最高可达99%。这表明Csm是一个高度稳定且高效的RNA敲低工具,可以对细胞质RNA和细胞核RNA都实现精确敲低。

CRISPR的新型RNA敲低工具问世,效率更高、脱靶率更低

crRNA转染后细胞内各靶点RNA的相对丰度

    随后,研究人员进行了RNA测序,以检查Csm介导的敲低在细胞中的潜在脱靶效应。相比于未处理样本,Csm 处理的样本在目标转录本上实现了显著敲低,同时几乎未产生其他差异表达的基因。相比之下,Cas13处理的样本在实现显著敲低的同时会产生数以千计的差异表达的脱靶基因。另外,RNAi(shRNA)处理的样本虽然差异表达的脱靶基因较少,但是其对细胞核RNA(例如MALAT1的敲低效果却欠佳。这表明Csm是三种RNA敲低方式中的最优选择。

CRISPR的新型RNA敲低工具问世,效率更高、脱靶率更低

Csm、Cas13或shRNA处理的细胞,与未处理细胞间转录水平的差异比较

    为了验证三种敲低方式产生的细胞毒性,研究人员分别用CsmCas13 shRNA 构建转染细胞后,使用WST-1检测细胞在一段时间内的增殖能力。结果表明,Cas13处理的细胞,其增殖能力显著下降,而Csm shRNA处理的细胞,其增殖能力则不受影响。

CRISPR的新型RNA敲低工具问世,效率更高、脱靶率更低

Csm、Cas13或shRNA转染后,细胞的相对活力/增殖能力比较

    综合本研究的各项实验结果,不难发现Csm介导的RNA敲低兼具Cas13shRNA策略的优点:同时拥有Cas13稳健的敲低和细胞核靶向能力,以及shRNA的最小的脱靶和细胞毒性。利用CRISPR-Csm,研究人员在人类细胞中实现了高效的RNA敲低(90%-99%),证实了多蛋白CRISPR-Cas效应子复合物作为真核生物RNA靶向工具的可行性和有效性。