EMSA胶体迁移实验又被称为胶体阻滞实验或电泳迁移率实验（EMSA），是一种用于研究蛋白质与核酸相互作用的技术。最初用于验证转录因子与启动子之间的相互作用，也可用于研究蛋白质与DNA、RNA的相互作用。

一、实验原理

EMSA胶体迁移实验的主要原理是基于蛋白质-探针复合物在凝胶电泳过程中迁移速度较慢。根据实验需求设计探针，当样本与探针混合孵育时，样本中与核酸探针结合的蛋白质会形成蛋白质-探针复合物；因为这种复合物的分子量较大，所以在聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中迁移速度相对较慢，而未结合蛋白质的探针则迁移速度较快。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳和转膜的步骤后，蛋白质-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，表明存在蛋白质与目标探针的相互作用。

二、实验操作步骤

1.蛋白样本制备

可以提取总蛋白样本、细胞核蛋白样本或使用已纯化好的目标蛋白。

2.探针制备

根据实验需求设计不同的探针，并为其添加标记。可以合成核酸后自行添加标记，也可以购买商业化的抗体，已知蛋白也可以直接购买。

3.凝胶制备

依次加入1mL5×TBE缓冲液、2.2mL 30%Acr/Bis、6.62mL重蒸水、80μl 80%甘油、90μl 10%过硫酸铵和10μl TEMED，制备10mL 6.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶（可根据试剂情况按比例调整总体积）。

4.蛋白质-探针复合物的制备

（1）在离心管中按顺序加入2μl蛋白样本、2μl EMSA/Gel-Shift结合缓冲液和5μl无核酸酶的去离子水，混匀后室温放置10分钟（消除可能发生的探针和蛋白质的非特异性结合）；

（2）加入1μl探针（对照组加入1μl对照探针），混匀；

（3）在室温（20-25℃）下放置20-30分钟；

（4）加入1μl EMSA/Gel-Shift上样缓冲液（无色，10X），混匀后立即上样。

注意：溴酚蓝有时会影响蛋白质和DNA的结合，建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果发现无法上样，可以在无色上样缓冲液中加入少量蓝色上样缓冲液，直至能够观察到蓝色即可。

4.电泳

（1）在预冷的0.5×TBE缓冲液中进行预电泳10分钟，电压设置120V。预电泳结束后冲洗样品孔；

（2）将混合样品和电泳缓冲液点样；

（3）将电泳槽放置在冰上或4℃环境中；

（4）电泳。

5.转膜

（1）在预冷的0.5×TBE缓冲液中浸泡凝胶、膜、滤纸和纤维垫。

（2）按照纤维垫、滤纸、凝胶、膜、滤纸和纤维垫的顺序装配“三明治”。注意凝胶需位于阴极，膜需位于阳极。

（3）在预冷的0.5×TBE缓冲液中进行转膜。转膜装置需放于冰上或低温环境下，恒压60V转膜1小时（可根据实际情况调整电压和时间）。

6.检测

（1）取出转好的膜，放入适合的含缓冲液的容器中进行冲洗。（注意整个检测过程避免膜干燥）

（2）除去缓冲液后，加入封闭液轻轻震荡，于室温下封闭20分钟。

（3）加入适量的HRP酶标记的链霉亲和素，室温震荡孵育45分钟（勿将酶标记物直接加到膜上）。

（4）去除酶联物稀释液，用洗涤缓冲液洗膜，每次室温轻轻震荡10分钟。

（5）将配制好的反应底物均匀加至膜上，在室温下孵育5分钟。（或在加完底物后，用薄膜轻轻覆盖在膜上，使底物均匀覆盖，注意不要产生气泡）

（6）化学发光成像系统曝光成像（曝光时间的长短可以根据检测方法不同进行相应调整）。

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