SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS-PAGE）是蛋白表达分析中应用最为广泛的一项技术，可用于检测蛋白质的表达情况和纯度等。依据样本中蛋白质的分子量差异，通过电泳凝胶，达到分离的目的。本文主要介绍SDS-PAGE凝胶电泳的实验原理、所需试剂以及实验步骤。

一、SDS-PAGE凝胶电泳原理

SDS-PAGE凝胶电泳是将蛋白样品加入样品处理液（SDS和巯基乙醇）中，并进行高温加热处理，使蛋白变性，多肽链内部和肽链之间的二硫键打开，使肽链呈现开放状态。打开的肽链通过疏水作用与SDS结合，带有负电荷，在电场的作用下向正极迁移。由于不同大小的肽链在迁移过程中受到的阻力不同，它们逐渐分离。

二、实验试剂

0.5mol/L Tris-HCl（pH6.8）；1.5mol/L Tris-HCl（pH8.8）；10%SDS（十二烷基硫酸钠）；10%过硫酸铵；30%丙烯酰胺（W/V）；TEMED（四甲基乙二胺）；5×上样缓冲液；考马斯亮蓝染色液；电极缓冲液；脱色液。

三、实验步骤

1.准备

将两块玻璃板对齐后，放入1mm硅夹条中，垂直放于架子上。（玻璃板必须对齐，以防止漏胶）

2.分离胶的配制（浓度应根据被分离蛋白的分子量选择）

以12％分离胶为例，配方如下：

将上述试剂充分混合后倒入两玻璃板之间的夹缝中，然后在胶的表面加入一层水进行水封，以加快胶的凝固。在室温下静置一段时间，待胶自然凝固（此时胶面与水封之间可见清晰的界限），将表层水倒掉。

3.浓缩胶的配制

以4％浓缩胶为例，配方如下：

将上述试剂充分混合后倒入两玻璃板之间的夹缝中，然后将1mm宽的梳子插入浓缩胶中，请确保梳子与浓缩胶之间没有任何气泡。当浓缩胶完全凝固后，小心地将梳子取出。

4. 电泳槽的组装

将制备好的分离胶及浓缩胶放于电泳槽内（注意小玻璃板朝向内部，大玻璃板朝向外部），然后加入电极缓冲液，加液时请确保内外槽的液面基本保持齐平。

5. 加样

取适量的蛋白样本，与5×上样缓冲液按照4:1的比例混合。在沸水浴中加热3-5分钟，使蛋白质完全变性。然后10000r/min离心5分钟，取上清液进行上样。

6. 电泳

盖好电泳槽的盖子，连接好电泳设备，打开电源。开始电泳时，先将电压调至80V，当样品进入分离胶时，调整电压使其保持在150V的恒定电压下。当溴酚蓝染料迁移到距离底部约0.5-1cm处时，关闭电源，停止电泳。将玻璃板从电泳槽中取出，并小心地取出玻璃板上的胶片。去除多余的浓缩胶，将分离胶放入塑料盒中进行染色。

7. 染色

将分离胶浸泡在考马斯亮蓝染色液中，进行染色2-4小时（在摇床上缓慢振荡），然后倒掉染色液，用自来水进行冲洗，去除凝胶和塑料盒中的染色残留物。

8. 脱色

使用脱色液进行脱色（在摇床上缓慢振荡），每小时更换一次脱色液，直至凝胶中的蛋白条带清晰可见，背景透明干净。

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