Western Blot是一种常见的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究。它可以检测复杂混合物中目标蛋白质的存在、定量和鉴定。本文重点介绍Western Blot的基本原理和步骤。

一、Western Blot的基本原理

利用电泳将待测蛋白质样品在凝胶中分离，然后将其转移到膜上，通过特异性抗体与目标蛋白质结合，并使用适当的探针对其进行检测。

二、Western Blot的步骤（以细胞样本为例）

需要准备的试剂：RIPA裂解缓冲液、蛋白酶抑制剂、PBS缓冲液、上样缓冲液（甘油、溴酚蓝等成分）、电泳缓冲液（SDS、甘氨酸等成分）、转膜缓冲液（SDS、甲醇、甘氨酸等成分）、封闭缓冲液（BSA、TBST等）、PVDF膜或硝酸纤维素膜。

（一）样品裂解

1. 将细胞培养皿放于冰上并用预冷的PBS洗涤细胞。

2. 吸出PBS，然后加入预冷的裂解缓冲液（每10⁷个细胞加1 mL；每5x10⁶个细胞加0.5 mL）。

3. 用预冷的塑料细胞刮刀将贴壁细胞从培养皿上刮下，然后轻轻将细胞悬液转移到预冷的小离心管中。或者用胰蛋白酶消化细胞并用PBS洗涤细胞，然后将细胞重悬浮于小离心管内的裂解缓冲液中，4℃下持续振摇30分钟。

4. 4℃离心（需要根据细胞类型选择离心力和离心时间）。

5. 轻轻地从离心机中取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到放置在冰上预冷的新管中，弃去沉淀。

（二）样品制备

样品裂解后，可以通过离心将细胞碎片和细胞器分离出来，获得细胞裂解液。取少量裂解液，测定每种细胞裂解液的蛋白质浓度。

（三）上样和跑胶

1. 准备SDS-PAGE凝胶，根据目标蛋白的大小选择合适的凝胶百分比。

2. 将等量的蛋白和分子量标志物上样至SDS-PAGE凝胶孔中。

3. 电泳时间和电压需要优化或根据厂商推荐操作。

（四）转膜

可使用硝酸纤维素膜或PVDF膜。用甲醇活化PVDF膜1分钟，在制备转膜层之前用转膜缓冲液冲洗PVDF。转膜时间和电压推荐按照厂商的说明进行操作。

（五）抗体染色

1. 用封闭缓冲液在室温下封闭膜1小时或在4℃下封闭过夜。

2. 用适当稀释的一抗在封闭缓冲液中孵育膜。建议在4℃下过夜孵育；其他条件可以优化。

3. TBST洗涤膜3次，每次5分钟。

4. 用推荐稀释度的偶联二抗在封闭缓冲液中室温孵育膜1小时。

5. TBST洗涤膜3次，每次5分钟。

（六）成像和分析

使用化学发光或荧光成像系统检测蛋白质信号。

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