简石生物总RNA抽提试剂(TR201)

产品简介：

简石生物总RNA抽提试剂(TR201)是可即用的从细胞和组织中提取总 RNA 的试剂，在样品裂解或匀浆过程中，可保持RNA 完整性，同时裂解细胞，溶解细胞内含物。加入氯仿后，溶液分为水相和有机相，RNA 在水相中。取出水相，用异丙醇可沉淀回收 RNA；中间层用乙醇沉淀可回收 DNA；有机相用异丙醇沉淀可回收蛋白。

实验操作步骤：

准备试剂：氯仿、异丙醇、RNase-free ddH20、75%乙醇(用RNase-free ddH2O配制)。

1. 匀浆处理

a. 植物组织：以叶片RNA 提取为例。取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在TRIcom中研磨，研磨要迅速，最好不要超过1 分钟。大约100 mg 叶片使用1 ml TRlcom；

b. 动物组织：以鼠肝脏RNA 提取为例。取新鲜或-70℃冻存组织，每30-50mg 组织加入1 mITRIcom，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积一般不要超过TRIcom体积的10%；

c. 单层培养细胞：单层贴壁细胞的收集(收集细胞数量请不要超过1x10⁷)：可直接在培养容器中裂解(容器体积不超过10cm)，或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀。(在摇瓶中培养的单层贴壁细胞通常采用胰蛋白酶处理的方法)；

1) 直接裂解法：直接在培养板中加入TRIcom裂解细胞，每10 cm²面积加入1 mlTRlcom。用取样器吹打几次；

注意：TRIcom加量根据培养板面积决定，不是由细胞数决定。如果TRIcom加量不足，可能导致提取的RNA中有DNA 污染。

2) 胰蛋白酶处理法：确定细胞数量，吸除培养基，用PBS 洗涤细胞，吸除PBS，向细胞中加入含有0.1-0.25%胰蛋白酶的PBS 处理细胞，当细胞脱离容器壁时，加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶，将细胞溶液转移至RNase-free 的离心管中，300xg 离心5 分钟，收集细胞沉淀，仔细吸除所有上清；

注意：收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净，否则会导致裂解不完全，造成RNA 的产量降低。

d. 细胞悬液：离心取细胞。每5x10⁶-10⁷动物、植物和酵母细胞或每10⁷细菌细胞加入1 mlTRIcom。加入TRIcom前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪处理；

e. 血液处理：直接取新鲜的血液，加入3 倍体积TRIcom(推荐0.25ml全血加入0.75mITRIcom)，充分振荡混匀；

2. 将匀浆样品在15-30℃放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离；

3. 可选步骤：4℃ 12,000 rpm(~13,400xg)离心10 分钟，取上清；

注意：如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。

4. 每使用1 ml TRlcom加入0.2 ml 氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15 秒，室温放置3分钟；

注意：如不能旋涡混匀，可手动颠倒混匀2分钟代替。

5. 4℃ 12,000 rpm(~13,400xg)离心10-15 分钟，样品会分成三层：有机相，中间层和上层无色的水相，RNA 主要在水相中，把水相(约500 μl)转移到新的离心管中；

6. 在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20-30 分钟；

7. 4℃ 12,000 rpm(~13,400xg)离心10 分钟，去上清。离心前RNA 沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀；

8. 加入1 ml 75%乙醇(DEPC处理过的水配制)洗涤沉淀。每使用1mITRIcom至少用1ml75%乙醇对沉淀进行洗涤；

9. 4℃ 5,000 rpm(~2,300xg)离心3 分钟。倒出液体，注意不要倒出沉淀，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸起沉淀；

10. 室温放置晾干(不要晾的过干，RNA 完全干燥后会很难溶解，大约晾干2-3分钟左右即可)，根据实验需要加入30-100μl RNase-free ddHz0，反复吹打、混匀，充分溶解RNA。

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